Soegijono

ini mungkin berguna

Study on genetik diversity and mating system in a seedling seed orchard of Pinus merkusii

Posted by soegijono pada 53

Pinus merkusii merupakan satu-satunya jenis pinus yang tersebar secara alami melewati garis katulistiwa dan mempunyai keistimewaan pada proses reproduksi yaitu berbunga dan menghasilkan buah sepanjang tahun (Mirov 1967).  Di Indonesia, P. merkusii adalah salah satu species pohon yang paling penting untuk kayu pertukangan, produksi resin dan untuk rehabilitasi lahan (Suhardi et al. 1994). Pemuliaan pohon untuk spesies ini dimulai pada tahun 70-an melalui pembangunan kebun benih (seedling seed orchard = SSO) dengan penanaman 1,000 famili-famili terpilih dari hutan tanaman yang ada di pulau Jawa (Soeseno 1988). Sistem perkawinan yang random (tidak memilih pasangannya) dan seimbang adalah salah satu faktor untuk kesuksesan sebuah strategi pemuliaan untuk menjaga dan meneruskan keragaman genetick pohon induk kepada keturunannya.  Selain itu, pembungaan yang serempak antar pohon-pohon induk bisa berpengaruh pada kuantitas dan kualitas produksi biji melalui sistem perkawinannya. Oleh karena itu, study pada karakteristik pembungaan P. merkusii merupakan hal yang penting untuk memastikan produksi biji yang mempunyai kualitas yang tinggi dibawah karakter pembungaan yang berbeda-beda.  Namun demikian tidak ada study sebelumnya yang menunjukkan hubungan antara pembungaan dan sistem perkawinan sehingga mempengaruhi keragaman genetik pada P. merkusii.

Tujuan secara luas dari studi ini adalah menetapkan managemen kebun benih yang ideal untuk memperoleh kualitas biji yang baik dan melanjutkan program pemuliaan dengan perolehan genetic yang lebih tinggi.  Sedangkan tujuan spesifik dari studi ini adalah (1) mengevaluasi keragaman genetik didalam kebun benih, untuk memperoleh informasi tentang status perkawinan, dengan menetapkan level keragaman genetik terpelihara dalam populasi pohon induk dan keturunannya dan (2) untuk mengetahui variasi pada sistem perkawinan dimana bisa mempengaruhi produktivitas dan keragaman genetik produksi biji, perbedaan pembungaan dan sistem perkawinan di dalam kebun benih.

Keseluruhan penelitian dalam disertasi ini berdasarkan data dan bahan yang berasal dari salah satu kebun benih P. merkusii di Indonesia yang terletak di Jember, Jawa Timur.

Seribu pohon plus dipilih secara phenotipik diseluruh pulau Jawa dan digunakan untuk pembangunan kebun benih yang dilaksanakan bertahap selama 6 tahun penanaman   dari 1978-1983 sebagai uji keturunan open pollinasi di 3 tempat di Jawa; Sumedang (Jawa Barat), Baturaden (Jawa Tengah) dan Jember (Jawa Timur) (Soeseno 1988).  Penyebaran P. merkusii di pulau Jawa mempunyai kekerabatan genetik yang tinggi karena kemungkinan berasal dari hanya satu sub populasi di sebaran alamnya di Aceh (Siregar dan Hattermer 2004).  Setiap tahun tanam ditanam 200 pohon plus dengan ulangan 5 tree plot dalam satu bloknya dan diulang dalam 10 blok.  Untuk penanaman tahun berikutnya, ada 40 pohon plus yang digunakan pada tahun sebelumnya ditambah 160 pohon plus yang baru.  Sehingga ada 1,000 family (200+ 160×5) ditanam di kebun benih.  Setelah seleksi akhir, tertinggal 600 family dan ada sekitar 6,000 pohon dengan spacing 4 sampai 16 m.   Komposisi asal pohon plus (distrik) dan jumlah family per tahun tanam berbeda-beda.

Luas area kebun benih 96 ha dengan topography datar, 600 m diatas permukaan laut. Kebun benih ini dikelilingi oleh tanaman komersial seperti Swietenia mahogany, Eucalyptus dan P. merkusii sepanjang 200 m sebagai area penetrasi pollen (Pollen dilution zone).

Pengembangan penanda microsatellite P. merkusii.

Informasi genetik yang akurat adalah penting untuk memanage dan mendesign stuktur kebun benih.  Sampai saat ini, informasi genetik di kebun benih baru dilakukan dengan isozyme analysis (Siregar dan Hattemer 2004).  Penanda microsatellite merupakan penanda ko-dominan dan dicirikan dengan tingginya tingkat polymorphism, sehingga penanda DNA ini merupakan alat yang powerful untuk studi dan konservasi keragaman genetik.  Namun demikian, penanda microsatellite untuk P. merkusii belum tersedia. Sehingga dalam studi ini penanda tersebut dikembangkan untuk mengetahui keragaman genetik dan sistem perkawinan didalam kebun benih P. merkusii.

Region microsatellite diisolasi menggunakan teknik dual suppression Polymerase chain reaction (PCR), mengikuti prosedur yang dikembangkan oleh Lian dan Hogetsu (2002). Sepuluh penanda microsatellite telah berhasil diisolasi dengan menggunakan teknik dual-suppression. Namun demikian, dari 10 penanda, 5 locus berkarakter codominan dan polymorphic, 2 monomorphic, 2 multiband and satu locus tidak dapat memunculkan pola band.  Sehingga hanya 7 penanda yang dapat digunakan seperti yang tertera dalam Tabel 3.1.

Tabel 3.1 Karakteristik tujuh penanda microsatellites diisolasi dari Pinus merkusii.  Keragaman allele dan heterozygositas dihitung dari 64 pohon dari kebun benih P. merkusii.

Jumlah allele yang teramati untuk setiap locus berkisar antara 3 sampai 6.  Nilai HE berkisar antara 0.389 sampai 0.728.  Ada tiga locus secara signifikan menyimpang dari hukum keseimbangan Hardy-Weinberg (HWE), karena kelebihan jumlah allele yang homozygote.  Ada kemungkinan locus ini adalah null-alleles. Namun sebaliknya, kekerabatan yang dekat antar individu pohon didalam kebun benih dapat juga menyebabkan penyimpangan hukum HWE ini.  Tidak ada penyimpangan linkage disequilibrium (L-D) yang terlihat dari locus-locus ini.  Dengan karakter seperti diatas, penanda microsatellite ini dapat digunakan untuk analisa genetik di kebun benih.

Tingkat keragaman genetik populasi pohon induk dan populasi offspring di kebun benih.

Hutan tanaman P. merkusii di pulau Jawa secara genetik berkerabat dengan salah satu sub-populasi di hutan alam Aceh (Siregar dan Hattermer 2004) sehingga keragaman genetik populasi pohon induk di kebun benih ada kemungkinan terbatas.  Sebaliknya, untuk melanjutkan program pemuliaan, keragaman genetik antar pohon induk harus terjaga sehingga menjamin keragaman genetik yang tinggi pada keturunannya.  Selain itu, sistem perkawinan di kebun benih harus random untuk memperoleh keragaman genetik dan perolehan genetik yang tinggi. Informasi tentang status perkawinan didalam kebun benih P. merkusii belum diketahui.  Tujuan dari studi ini adalah (1) untuk memperjelas latar belakang genetik pohon plus terseleksi yang digunakan untuk pembangunan kebun benih dan (2) untuk memperoleh informasi tentang status perkawinan didalam kebun benih  dengan cara membandingkan tingkat keragaman genetik antara populasi induk dan offspring.

Satu blok pada setiap tahun tanam seperti diperlihatkan pada Gambar 2 diuji keragaman genetiknya.  Untuk populasi pohon induk, 100-130 sampel daun dikoleksi dari blok-blok yang telah dipilih.   Untuk populasi offspring, 48 kecambah dari 5000 cone per blok dikoleksi secara acak dan digunakan analisa DNA.  Analisa genetik menggunakan 5 penanda microsatellite. Parameter genetik seperti heterozygosity yang diharapkan (HE) dan coefficient inbreeding (FIS) dihitung menggunakan FSTAT software (Goudet 2001). Gambar 2. Blok-blok di kebun benih yang diuji keragaman genetiknya

Hasil dari studi ini menunjukkan adanya kemiripan parameter keragaman genetik  antar distrik, dimana pohon induk di kebun benih diseleksi, (HE = 0,445-0,557), dan nilai perbedaan genetik antar distrik sangat kecil (FST = 0.008).  Hasil ini menunjukkan tingginya derajat kesamaan genetik antar distrik sebagai daerah asal pohon induk. Hasil penelitian ini mendukung pendapat dari studi sebelumnya yang melaporkankan bahwa pohon induk didalam kebun benih tersebut berasal dari material genetik yang mempunyai kekerabatan yang tinggi.

Status perkawinan di dalam kebun benih diperoleh dengan membandingkan keragaman genetik antara populasi pohon induk dengan populasi offspring.  Parameter keragaman genetik antara populasi populasi induk dan populasi offspring tertera diTabel 4.1.

Keragaman genetik harapan (expected heterozygosity=HE) lebih tinggi pada populasi offspring (rata-rata=0.601 dan 0.545, nilai masing-masing) dibandingkan populasi pohon induk (rata-rata=0.471 dan 0.489, nilai masing-masing) pada sebagian besar blok.  Nilai FIS tidak secara signifikan menyimpang dari nol pada populasi pohon induk maupun offspring. Signifikan linkage disequilibrium hanya teramati pada populasi induk (rata-rata=2.00).  Ukuran populasi efektif (effective population size)  lebih tinggi pada populasi offspring (rata-rata=606.22) dibandingkan populasi pohon induk (rata-rata=486.53).  Nilai FST antar populasi pohon induk dan offspring masing-masing 0.038 and 0.029.  Berdasarkan hasil tersebut diatas  diketahui bahwa produksi biji di kebun benih merupakan hasil berkawinan mendekati panmictic dan pertukaran genetik terjadi secara bebas antar pohon induk.  Disimpulkan pohon induk di kebun benih memilki keseragaman genetik yang tinggi, sehingga keserampakan berbunga bisa diharapkan.  Keragaman genetik pohon induk dimasukkan dalam kategori moderat. Tingginya keragaman genetik masih terjaga pada generasi offspring, bahkan adanya kemiripan genetik dengan pohon induk, sehingga status perkawinan dalam kebun benih termasuk panmictic dan gene flow yang luas.

Variasi pada sistem perkawinan di dalam kebun benih

Pada kebun benih jenis Pinus di daerah temperate, dimana pembungaan terjadi sekali dalam satu tahun, karakter pembungaan sangat berpengaruh pada produksi biji (El-Kassaby et al.1984). Sedangkan P. merkusii, proses reproduksi sepanjang tahun, pengaruh pembungaan terhadap produksi biji belum diketahui.  Produksi biji yang berfluktuasi di kebun benih kemungkinan disebabkan oleh produksi bunga yang bervariasi.  Chapter 5 terdiri dari 2 sub chapter (1) Variasi pembungaan (2) Sistem perkawinan.

Studi plot berukuran 250 x 250 m terletak di tengah-tengah kebun benih (Gambar 3).  Penghitungan terhadap bunga betina dan jantan dilakukan terhadap seluruh pohon yang ada di studi plot (644 pohon dari 145 famili).  Uji produksi biji dan keragaman genetik dilakukan terhadap 44 pohon induk yang dipilih berdasarkan radius (Gambar 3, kanan).

Variasi pada karakter pembungaan dan produksi biji.

Pembungaan seimbang di kebun benih mendorong keseimbangan panmixia (Choi et al 2004).  Namun, kondisi ideal tersebut jarang tercapai (Burczyk dan Chalupta 1997).  Pembungaan tidak seimbang antara jumlah bunga betina dan jantan menyebabkan tingginya tingkat aborsi embrio karena selfing atau inbreeading.  Pengaruh pembungaan sepanjang tahun P. merkusii terhadap produksi biji belum diketahui.

Penghitungan jumlah cluster bunga betina dan jantan dilakukan terhadap 644 pohon dewasa.  Untuk mengamati jumlah pollen yang tersebar pada saat polinasi, 25 pollen trap dipasang.  Produksi biji dan keragamannya dilakukan terhadap 44 pohon induk.  Pengamatan dilakukan pada bulan Agustus 2005, November 2005 dan Maret 2006.

Jumlah cluster bunga betina dan jantan pada tiga bulan pengamatan diperlihatkan pada Tabel 5.1.  Jumlah bunga betina yang berlebih tetapi bunga jantan yang sedikit diamati dibulan Agustus (62.2 vs. 4.5), bunga betina dan bunga jantan berjumlah sedang diamati pada moderate female November (37.9 vs. 28.4) dan bunga betina berjumlah sedang dan bunga jantan yang berjumlah sedikit diamati pada bulan Maret (35.3 vs. 5.4).  Butir pollen berjumlah sedikit pada bulan Agustus (1.2±0.7) dan Maret (1.3 ±1.5), dan lebih banyak di bulan November (3.4±6.1).  Hasil ini menunjukkan kelimpahan pollen berhubungan dengan frekuensi bunga jantan.

Tabel 5.1 Jumlah bunga betina dan bunga jantan per pohon (± SD) dan perbedaan yang signifikan seperti yang diindikasikan dengan T-test (LSD), rasio bunga jantan-betina (± SD) dan coefisien variasi (CV) di setiap bulan pengamatan

Jumlah biji per cone dan jumlah biji bernas per cone di setiap bulan pengamatan disajikan pada Tabel 5.2.  Jumlah biji per cone lebih banyak di bulan Maret dibanding pada bulan November dan Agustus.    Jumlah biji bernas per cone lebih banyak di bulan November dan Maret tetapi sedikit di bulan Agustus.   Oleh karena ketidakseimbangan pembungaan dapat mengakibatkan kekurangan pollen sehingga mempengaruhi jumlah biji bernas dengan meningkatnya laju selfing.  Kekurangan pollen bisa menyebabkan pollen yang berkualitas jelek menggantikan fertilisasi sehingga menghasilkan progeny yang lemah.

Parameter keragaman genetik pada populasi offspring disajikan pada Tabel 5.3.  Antar populasi offspring, ada kemiripan nilai jumlah allele (NA) pada November (21) dan Maret (22) dan nilai tertinggi pada bulan Agustus (27).  Nilai HO diperoleh lebih tinggi pada bulan Agustus (0.384) dibandingkan bulan November (0.349) dan Maret (0.314), sedangkan nilai HE mirip antara Agustus (0.402) dan November (0.397), tetapi nilainya lebih rendah di bulan Maret (0.361).  Nilai FIS diperoleh lebih rendah pada bulan Agustus (0.046) dibanding bulan November (0.120) dan Maret (0.131).  Nilai L-D didapatkan paling tinggi di bulan Agustus (6) dan nilainya sama antara bulan November (2) dan Maret (2). Kurangnya pollen bisa menyebabkan pergantian pollinasi yang berasal dari pollen yang berada jauh dari sebuah pohon induk (mother tree), dimana bisa menerangkan lebih tingginya nilai NA dan HE pada bulan Agustus dibandingkan bulan November dan Maret. Akibat lain pada populasi yang jumlahnya pollen tidak cukup, menyebabkan kesempatan untuk selfing.  Berdasarkan hasil-hasil diatas, bisa dilaporkan bahwa tingginya nilai signifikan L-D pada bulan Agustus bisa mengindikasikan kejadian perkawinan tidak random. Pada bulan November, mendekati keseimbangan panmictic dan laju selfing minimum dapat diharapkan karena seimbang antara bunga betina dan bunga jantan serta tercukupinya jumlah pollen.  Karena kondisi perkawinan seperti diatas menyebabkan tingginya nilai HE pada bulan in November.  Pada bulan Maret, terbatasnya jumlah bunga betina dan bunga jantan bisa memacu terbatasnya penyebaran pollen yang menyebabkan rendahnya nilai HE dan tingginya FIS.  Selain itu, nilai FST antara opulasi induk dan offspring secara signifikan berbeda masing-masing 0.034, 0.031 and 0.054 pada bulan Agustus, November dan Maret.  Rendahnya nilai FST menunjukkan gene flow yang luas pada bulan Agustus dan mendekati panmictic pada bulan November.

Dari hasil yang diperoleh, disimpulkan bahwa meskipun P. merkusii berbunga sepanjang tahun, namun karakter pembungaan berbeda-beda tergantung pada musim.  Karakter pembungaan berpengaruh tidak hanya terhadap produksi biji tetapi juga keragaman genetik biji yang diperoleh di kebun benih.

Sub Chapter 2 berjudul pola sistem perkawinan dan pollen flow.  Sistem perkawinan adalah pola transmisi informasi genetik dari induk kepada keturunannya.  Pollen flow adalah jumlah dan jarak penyebaran pollen yang berperan dalam perkawinan.  Akibat pembungaan yang tidak seimbang; kontribusi gamet yang tidak seimbang dalam sistem perkawinan menyebabkan menurunnya panmixia, tingginya nilai selfing, penggantian fertilisasi dari pollen yang berjarak jauh dari pohon induk.  Sub Chapter 2 bertujuan menjelaskan variasi pada sistem perkawinan di dalam kebun benih pada saat pembungaan tidak seimbang.

Untuk menjelaskan sistem perkawinan dan gene flow digunakan 3 pendekatan analisis; analisa radius, mixed-mating model dan neighborhood model. Analisa radius mengetahui ukuran panmixia (dihitung dengan FSTAT software, Goudet 2001).  Mixed-mating model menilai laju selfing dan outcrossing (dihitung dengan MLTR software, Ritland 2002).  Neighborhood model menilai selfing, gene flow dan lokal pollen pada area tertentu (dihitung dengan Neighbor, Burczyk et al 2002).   

Ukuran panmixia pada setiap bulan pengamatan dilihat di tabel 5.4.  Analisis berdasarkan radius menunjukkan nilai FIS tidak signifikan pada radius diatas 108 m, 36m dan 12m masing-masing pada bulan Agustus, November dan Maret. Nilai L-D tinggi pada bulan Agustus (1-6), dan rendah pada bulan November dan Maret (1-2 pada dua bulan tersebut).  Perubahan perbedaan genetic (FST) antara populasi offspring di radius 12m dan populasi pohon induk berbeda radius bernilai tinggi pada bulan Agustus dan Maret tapi rendah di bulan November.  Kejadian pengganti fertilisasi dari pollen yang berjarak jauh dari pohon induk.  Penggantian fertilisasi yang berasal dari pollen yang jauh dari pohon induk pada bulan Agustus dapat dijelaskan dengan ukuran radius yang besar untuk mendapatkan nilai FIS yang signifikan. Tingginya tingkat selfing dapat dijelaskan dengan tingginya nilai L-D.  Perkawinan antar pohon disekitar pohon induk pada bulan November bisa diterangkan dengan ukuran radius yang tidak terlalu besar untuk mendapatkan nilai signifikan FIS.  Rendahnya nilai FST dapat menerangkan keseimbangan panmictic pada bulan November.  Keterbatasan gene flow pada bulan Maret dapat diterangkan dengan kecilnya jarak untuk mendapatkan nilai signifikan FIS dan tingginya nilai FST. Tabel 5.4  Ukuran panmixia berdasarkan analisis radius pada setiap musim pengamatan

Penafsiran laju outcrossing dan coefficient paternity dilihat pada Tabel 5.5.  Mixed-mating model menunjukkan rata-rata multilocus outcrossing rate (tm) lebih tinggi pada bulan November (0.962) dibandingkan pada bulan Agustus (0.941) dan Maret (0.956). Paternity correlasi (rp) paling tinggi pada progeny Agustus (0.304) dan sedang untuk progeny bulan November (0.205) dan Maret (0.193).  Tidak tercukupinya pollen pada bulan Agustus bisa menyebabkan rendahnya nilai tm dan tingginya rp, sebaliknya tercukupinya jumlah pollen pada bulan November dan Maret bisa menyebabkan tingginya tm dan rendahnya rp.  Rendahnya nilai tm menunjukkan tingginya selfing pada bulan Agustus.  Selain itu, tingginya nilai rp menunjukkan tidak tercukupinya jumlah pollen. Tingginya tm dan rendahnya rp pada bulan November dan Maret menunjukkan tercukupinya pollen pada kedua musim.   Tabel 5.5 Penafsiran laju outcrossing menggunakan mixed-mating model

Salah satu keuntungan dari  neighbourhood model adalah menerangkan pengaruh dari migratory pollen (m).  Penilaian laju selfing diperoleh dengan membandingkan nilai selfing yang diperoleh dengan menggunakan mixed-mating model dan neighborhood model.  Hasil laju selfing, migrasi pollen dan effective population size pada setiap bulan pengamatan diperlihatkan pada Tabel 5.6.  Laju selfing lebih tinggi pada bulan Agustus (s=0.06) dibandingkan pada bulan November (0.02) dan Maret (0.04).  Pergantian fertilisasi dari pollen yang berjarak jauh pada bulan Agustus dapat diterangkan dengan paling tingginya nilai immigration pollen rate (m=0.03) dibandingkan dengan November (0.01) dan March (0.02).  Keseimbangan panmictic pada bulan November dapat diterangkan dengan lebih tingginya nilai effective population size (71.42%) dibandingkan bulan Agustus (54.08%) dan Maret (24.68%). Tabel 5.6 Parameter menunjukkan pola gene flow

Dengan menggunakan 3 pendekatan analisis ini, bisa menggambarkan real sistem perkawinan yang tergantung pada musim di dalam kebun benih, dimana tergantung pada karakter pembungaan dari masing-masing pohon induk.   Ringkasan hubungan antara pembungaan, sistem perkawinan dan gene flow dapat dilihat di Tabel 5.7  Hubungan antara pembungaan, sistem perkawinan dan gene flow

Walaupun pohon induk didalam kebun benih secara genetik berkerabat, namun keragaman genetik yang sedang (moderate) tetap terjaga.   Keragaman genetic di kebun benih terjaga dalam populasi offspring karena perkawinan yang mendekati panmictic dan tingginya gene flow. Namun demikian, fluktuasi pembungaan temporal berpengaruh besar terhadap poduksi biji dan keragaman genetik offspring.  Pembungaan yang tidak seimbang bisa mengawali pollen yang jumlahnya tidak mencukupi dan membuat rendahnya kompetisi pollen.  Sebaliknya, keseimbangan jumlah bunga betina dan jantan mendorong keseimbangan panmictic.  Perbedaan karakter pembungaan berpengaruh pada sistem perkawinan dan pola gene flow disebagian area didalam kebun benih dimana menyebabkan perbedaan produksi biji dan keragaman genetik antar musim.  Namun demikian, karena pohon induk di kebun benih cenderung mempunyai laju outcrossing yang tinggi,  sehingga keragaman genetic yang tinggi dari kebun benih bisa diharapkan pada semua musim perkawinan.  Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa pembungaan dan status perkawinan dapat ditunjuk sebagai factor untuk menentukan produksi biji yang baik. Phenology reproduksi harus dimasukkan dalam layout dan design dari kebun benih dimasa depan untuk meningkatkan panmixia.  Study pada proses reproduksi P. merkusii harus dilakukan lebih frequentif untuk memperoleh penilaian lebih akurat pada mating system didalam kebun benih.

DAFTAR PUSTAKA

Burczyk, J., Adams, W.T., Moran, G.F. and Griffin, A.R. (2002) Complex patterns of mating revealed in Eucalyptus regnans seed orchard using allozyme markers and the neighbourhood model. Molecular Ecology 11: 2379-2391

Burczyk, J., Chalupka, W. (1997) Flowering and cone production variability and its effect on parental balance in a Scots pine clonal seed orchard. Annual Science Forest 54: 129-144

Choi, W.Y., Kang, K.S., Jang, K.W., Han, S.U., Kim, C.S. (2004) Sexual asymmetry based on flowering assessment in a clonal seed orchard of Pinus densiflora.  Silvae Genetica 53 (2): 55-59

El-Kassaby, Y.A., Fashler, A.M.K., Sziklai, O. (1984) Reproductive penology and its impact on genetically improve seed production in a Douglass-fir seed orchard.  Silvae Genetica 33 (4-5): 120-125

Goudet, J. (2001) FSTAT (version 2.9.3.): A program to estimate and test gene diversities and fixation indices. www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html

Lian, C. and Hogetsu, T. 2002.  Development of microsatellite markers in black locust (Robinia pseudoacacia) using a dual-suppression-PCR technique. Molecular Ecology Notes 2: 211-213

Mirov, N.T. (1967) The genus of Pinus. Roland Press Company. New York. 602 pp.

Ritland, K. (2002) Extensions of models for the estimation of mating system using n independent loci. Heredity 88: 221-228

Soeseno, O. H. (1988) Genetic variation and improvement of Pinus merkusii Jungh. et de Vriese. Doctoral Thesis, Gadjah Mada University, Indonesia 266pp.

Suhardi, Sosef, M.S.M., Laming, P.B., Ilic, J. (1994). Pinus L. In Plant Resources of South-East Asia 5(1) Timber trees: Major commercial. Jansen, P.C.M., Westphal, E., Kartasubrata, J. (eds.) 349-357 pp. PROSEA Bogor Indonesia 610 pp.

Sorry, the comment form is closed at this time.

 
%d blogger menyukai ini: